百脉根总DNA的提取采用CTAB法进行提取，提取程序如下：

（1）取适量（约1.3克）的低温保存的百脉根叶片，用液氮研磨成粉末状，分装于1.5 ml的离心管中。

（2）取1 ml 95℃预热的1.5×CTAB加入研磨好的装有叶片组织的离心管内，小心混匀。

（3）立即将离心管进行65℃水浴30 min，每5 min颠倒一次。

（4）12000 rpm离心5 min；吸取上清液600μl至另外1.5 ml离心管内，加入等体积氯仿/异戊醇（24∶1），颠倒至下层液相为深绿色。

（5）12000 rpm离心5 min，取450μl上清夜至另外的1.5 ml离心管内，加入两倍体积的无水乙醇和1/10体积的10 M NaAc，摇匀。

（6）12000 rpm离心10 min。

（7）弃上清液，加400μl无水乙醇浸洗沉淀5 min。

（8）弃上层溶液，风干。

（9）加入40μl含Rnase的无菌水。

（1）接单菌落至5mlYPD于30℃，225 rpm过夜培养。

（2）12000 rpm离心15s收集菌体，加1ml纯水洗涤。

（3）将菌溶于500μl Lysis buffer，加入酸洗过的细小玻璃珠至1.25ml，震荡2min。

（4）加入pH7.0的7mol/L的醋酸铵275 μl，混合后于65℃加热5min，置冰上5min。

（5）加入500 μl氯仿，混匀后离心5min。

（6）吸上清，1ml异丙醇沉淀，室温放置5min，12000 rpm离心5min。

（7）0%乙醇等体积沉淀，抽干，加入30μl水。

Lysis buffer（100ml）

Triton-x-100　　　  　　　  　2ml

10%SDS　　　　　 　　　   10ml

5M Nacl　　　　　 　　　　  2ml

1M Tris-Hcl(pH 8.0) 　　  　 1ml

0.5M EDTA　　　　 　　 　 0.2ml

H2O　　　　　  　　　  　84.8ml

卡介苗（BGC）的RNA提取：BGC在G+菌中也是算比较难提取的，主要是其细胞壁太厚，一般的方法比较难破壁。对于RNA的提取，不论是用TRIZOL，还是试剂盒，说明书上都有比较详细的操作步骤，对于一般的常见样品（细胞、大肠杆菌等）都能得到比较好的效果。RNA的提取，关键步骤之一是样品的前处理。前处理的目的是使RNA从细胞中完整的释放出来并且使RNA的释放过程中尽量减少被Rnase的降解。如果前处理做好了，RNA的提取再按照试剂盒说明书的步骤来，几乎都能成功。这里主要介绍对于细胞壁太厚，需要研磨的材料的前处理，以BGC为例。提取BGC的RNA前处理，采用液氮研磨法，其步骤如下：

（1）将研磨用具牛皮纸包好干灭。

（2）将研磨用具使用前在－80℃下预冻1h以上。

（3）将BGC（最好对数生长期）4℃，13000 rpm离心2min收集菌体，准备研磨。

（下面的操作越迅速越好，并注意做好防护，避免冻伤）

（4）将预冷的研钵取出，倒入液氮，铺满研钵底部，大约20ml左右即可，迅速刮出离心管里的菌体置于钵内，用研杵研磨。菌体在液氮下会被冻脆，很容易研磨成粉末。（注：菌体尽量干燥，有水会使得研磨困难；若研磨时间过长，可在研磨途中适当补加液氮，尽量不让液氮挥发干；研磨可在冰上进行）。

（5）用勺子迅速将研好的粉末刮入Rnase-free的EP管中，立即加入试剂盒中配好的裂解液，混匀（若是用TRIZOL提取，则加入合适量的TRIZOL即可）。（注：①也可将TRIZOL加入研钵中研磨到TRIZOL融化，然后将液体吸入EP管中。试剂盒提取时，由于加入的裂解液量较少，不建议把裂解液加入研钵中。②病毒RNA提取直接取病毒原液加入10倍体积TRIZOL即可）。

（6）接下来的步骤可按照说明书操作即可。

（以下提供用TRIZOL的提取步骤）

（7）室温放置5min，再按每毫升TRIZOL加0.2毫升的氯仿，盖紧EP管后剧烈振荡15s。

（8）取上层水相于另一EP管（宁可少取，不要吸到下层物质），按每毫升TRIZOL加0.5毫升异丙醇后室温放置10min。

（9）12000 rpm离心10min后弃上清，按每毫升TRIZOL至少加入1ml的75%乙醇，混匀后4℃下7500 rpm离心5min。重复该步骤1次。

（10）弃上清，室温干燥5～10min（注：过度干燥会降低RNA溶解度）。

（11）将RNA溶于Rnase-free的水中，分装后在－80℃保存。

（12）1%琼脂胶（含0.1%(V/V)左右的EB），1x TAE缓冲液（最好用DEPC水配制），加样2μg左右，90～100V电压下琼脂糖凝胶电泳检测。

【注意】提RNA要勤换手套，最好戴口罩，尽量在人少的时候中提取，提取时候操作尽量迅速。　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 

（1）取结核分枝杆菌H37Rv菌种1 ml加入到100 ml 无菌7H9液体培养基中。

（2）37℃静置培养约2～4周。

（3）将50 ml液体培养的结核杆菌在80℃水浴1h灭活细菌。

（以上步骤须在P3实验室内进行）

（4）室温，12000 rpm离心2 min。

（5）弃上清，加入10 ml 1×TE重悬细菌。

（6）室温，12000 rpm离心2 min。

（7）弃上清，用3 ml 1×TE重悬细菌，加溶菌酶至终浓度5 mg/ml，37℃振荡2 h。

（8）加入蛋白酶K至终浓度1 mg/ml，加入10% SDS至终浓度1%，37℃振荡过夜。

（9）待冷却至室温后，加等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1），缓慢翻转10 min混合两相形成乳浊液。

（10）4℃，12000 rpm离心10 min分离两相。

（11）将上清转移到另一离心管，加入等体积的氯仿∶异戊醇（24∶1），缓慢翻转混匀两相10 min。

（12）4℃，12000 rpm离心10 min。

（13）将上清转移到另一离心管，加入1/10体积的3 mol/L 醋酸钠溶液（pH5.2）和2倍体积预冷的无水乙醇，－20℃过夜。

（14）4℃，12000 rpm离心20 min。

（15）弃上清，沉淀用75%乙醇漂洗1次，真空抽干或自然干燥，加入适量无菌去离子水，溶解后的DNA贮存于－20℃。

【试剂】

TES：15ml 1M Tris.Cl（pH8.0）+0.6ml 0.5M EDTA（pH8.0）+75g蔗糖定容到300ml。

TEN：30ml 1M Tris.Cl（pH8.0）+60ml 0.5M EDTA（pH8.0）+2.6325g蔗糖定容到300ml。

TE（pH7.5）：5ml 1M Tris.Cl（pH8.0）+1ml 0.5M EDTA（pH8.0），用浓盐酸调节pH值至7.5；定容到300ml。

3M NaAc：122.472g NaAc，定容到300ml。

10%SDS：50g SDS加水定容到500ml。

　　操作步骤：

（1）收集对数生长后期的蓝细菌培养物，8000 rpm离心2min，弃上清。

（2）将沉淀转移至2ml离心管中，10000 rpm离心1min，去上清。

（3）400μlTES溶液悬浮沉淀，加入1%的sarkosyl，使最终浓度为0.1%，37℃温浴2小时（注：对于Anabaena 步骤3可省）。

（4）用1ml TEN溶液洗菌2次，10000 rpm离心1min，去上清。

（5）用500μl的TEN悬浮菌体，加入溶菌酶使终浓度为0.5mg/ml，37℃温浴1小时。

（6）加入10%SDS使终浓度为1%，加入20mg/ml的蛋白酶K使得最终浓度为0.5mg/ml，37℃温浴1小时。

（7）加入等体积的苯酚∶氯仿，涡旋，12000 rpm离心5min，收集上清液。再重复（7）步骤 2次。

（8）加入等体积的氯仿提取1次，12000 rpm 离心5min，收集上清液。

（9）加入1/10体积的NaAc(醋酸钠)，2.5倍体积的无水乙醇，-20℃下存放10～30min，12000 rpm离心5min，弃上清。

（10）用70%的乙醇暂短浸泡，短暂离心，弃上清。

（11）沉淀风干后，重溶于50μlTE中待用。

（1）经活化的菌，接种于5ml LB液体培养基中（注意有的需要加相应的抗生素）。

（2）生长至对数中期(约4h)收集菌体（12000 rpm/30s），STE洗涤1次。

（3）菌体悬于100μL 溶液I，加5～10μL溶菌酶液（浓度50～100mg/ml）。冰上静置2～3h或过夜。

（4）加200μL 2％SDS，55～60℃，温浴30min。

（5）加100μL 5M的NaCl溶液，混匀，室温或者冰上静置5～10min。

（6）12000 rpm离心5min，取上清液。

（7）苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）提取2～3次，12000 rpm离心5min，取上层液体。

（8）二倍体积无水乙醇沉淀，-20℃，15min～2h。

（9）12000 rpm离心5min，弃上清液。

（10）用70%乙醇沉淀1次，真空抽干。

（11）沉淀溶于20μL RNase 液中（20μg /ml）。

（12）3～5μL 点样电泳，检测。